間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基

MSC BeautiStemTM XF Medium

一、目的：利用間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。二、材料：新生兒臍帶

三、主要儀器：醫(yī)用手術(shù)器械，生物安全柜，CO₂ 培養(yǎng)箱，6 孔培養(yǎng)板，T25 培養(yǎng)瓶

四、試劑：

表 1 MSC BeautiStemTM XF Medium

表 2 建議選用試劑

五，實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

5.1  *培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

5.1.1 凍存的 MSC BeautiStem^TM XF Supplement 在室溫或 2-8℃解凍，避免反復(fù)凍融。

5.1.2   配制：MSC  BeautiStem^TM   XF  Basal  Medium（培養(yǎng)基）：MSC  BeautiStem^TM   XF

Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2 周內(nèi)使用。

注 1：雙抗非必須，建議原代（P0）時(shí)使用。

注 2：培養(yǎng)基含 L-Glutamine，貯藏時(shí)避免長(zhǎng)期照光。

5.2  包被培養(yǎng)皿

或跳過(guò)此步驟，直接加 2%血小板裂解物（P0500LT），促進(jìn) MSC 細(xì)胞貼壁與生長(zhǎng)。

          5.2.1 使用 DPBS 溶液（貨號(hào)：NA023-500ML），將 MSC 貼壁試劑稀釋 100 倍（1:100）。

          5.2.2 參照表 3，加入適量的 1XMSC 貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。

表 3  涂層過(guò)程中貼壁試劑建議使用量

 注 1：涂層的培養(yǎng)皿需在無(wú)菌條件下 2℃-8℃儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。（標(biāo)示紅色為原廠建議使用量，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試后可減半使用）

注 2：包被期間， 注意包被液不可以干掉！

注 3：若使用預(yù)包被培養(yǎng)瓶（Corning 的 CellBind，貨號(hào)：3289/3290 等）, 步驟 5.2 的包被可略過(guò)。

           5.2.3  輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。

           5.2.4 在 2-8℃孵育過(guò)夜；或者在 CO₂ 培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育 30 分鐘。

           5.2.5 接種前, 吸除貼壁試劑，再用 DPBS 輕輕沖洗培養(yǎng)皿，即可接種細(xì)胞。

5.3  制備 1X 大豆胰酶抑制劑

           5.3.1 使用無(wú)菌的 DPBS，將 50X 大豆胰酶抑制劑（NA048-20ML）稀釋成 1X。

六、使用范例：

6.1  UC-MSC 原代培養(yǎng) （組織塊法）

             6.1.1 無(wú)菌條件下取新鮮臍帶，用 DPBS 漂洗凈血跡

*   一般臍帶取得非無(wú)菌環(huán)境，可以稍微用 75%酒精潤(rùn)洗。

              6.1.2 置 10cm 培養(yǎng)皿中，剪成 1~2cm 臍段，剔除血管，用 DPBS 洗凈血跡，再剪成 1mm3

組織塊。(圖 1)

               6.1.3 用無(wú)菌滴管吸取少量細(xì)小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個(gè)孔中。

               6.1.4  37℃，5%CO₂ 培養(yǎng)箱孵育 30min，以使組織塊粘貼在培養(yǎng)皿壁上。

6.1.5  向每孔滴加 0.8ml *培養(yǎng)基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使沖動(dòng)組織塊)。

 6.1.6  37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，次日 (D1) 每孔再補(bǔ)加 1ml *培養(yǎng)基。

                6.1.7 37℃，5% CO₂ 繼續(xù)培養(yǎng)，5 天 (D6) 后半量換液 (此時(shí)一般看不到細(xì)胞，但快 3

天就可看到細(xì)胞從組織邊沿爬出)。

           6.1.8 再過(guò) 5 天后半量換液 (此時(shí)一般會(huì)有細(xì)胞爬出，但晚可到 14 天會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞從組織邊沿爬出) (圖 2、圖 3)。

 6.1.9 每 2 天換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 2~4 天，待細(xì)胞融合度（Confluency）達(dá)到約 80%

后傳代培養(yǎng)(圖 4)。

注 1：組織塊培養(yǎng)的關(guān)鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動(dòng)作要盡可能輕微，避免沖動(dòng)組織塊。培養(yǎng)基加量不能太多，以免組織塊漂浮。

注 2：為增加成功率，從原代分離臍帶和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞, 培養(yǎng)基可加 2.5%的人 AB 血清(人 AB 型血清必須除菌過(guò)濾，且 HbsAG 及 HCV/HIV 抗體陰性)。

6.2  UC-MSC 原代培養(yǎng) （消化法）

MSC BeautiStem^TM  XF Medium 也能有效地培養(yǎng)消化法取得的原代細(xì)胞，操做方式可依各實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)步驟，或參考上海中韜 MSC ACF Tissue Digestive Mix (貨號(hào)：C35010010) 的使用說(shuō)明。

6.2.1  將臍帶用 DPBS 漂洗干凈，剪成 1-2cm,后剔除血管。

*   一般臍帶取得非無(wú)菌環(huán)境，可以稍微用 75%酒精潤(rùn)洗。

6.2.2 將組織剪成 3-5mm3 后，移入 50ml 離心管，再加入的分離液。

*   一條長(zhǎng)度 10 公分的臍帶建議加入 10ml 的分離液；或者組織塊 : 分離液（vol）= 1:1。

** 視情況而定，可自行在分離液中添加 1%青鏈雙抗(BI, Cat# 03-031-1B) 。

6.2.3 把 50ml 離心管橫放在 37 度細(xì)胞培養(yǎng)箱，過(guò)夜反應(yīng)（16 小時(shí)）。

*   若總反應(yīng)體積較大，也可持續(xù)旋轉(zhuǎn)混合。

6.2.4 加入和分離液等體積的 0.05%EDTA（NANOLAB, Cat#NA015-100ML）終止反應(yīng)后，1500 xg 離心5 分鐘，去除上清。

*   溶液比較濃稠，小心不要影響下層的細(xì)胞;建議留下 5ml 左右的溶液。

** 若是脂肪組織，沒(méi)有粘稠的情形，以常規(guī)的 200-300 xg 離心即可。

*** 沒(méi)有 EDTA, 可使用無(wú)鈣鎂 DPBS 取代；此時(shí)建議后面步驟 6 多重復(fù) 2-3 次，以確實(shí)去除酵素。

6.2.5 以和分離液等體積的無(wú)鈣鎂 DPBS 重懸細(xì)胞后，500 xg 離心 5 分鐘，去除上清。

6.2.6 再次以和分離液等體積的無(wú)鈣鎂 DPBS 重懸細(xì)胞后，250 xg 離心 5 分鐘，去除上清。

6.2.7 用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，即可按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法接種 P0 代細(xì)胞培養(yǎng)。

*   消化后的原代細(xì)胞，建議培養(yǎng)時(shí)接種密度提高到 10,000/cm2 以上；傳代后即可按常規(guī)的接種密度培養(yǎng)。

6.3  UC-MSC 傳代培養(yǎng)與凍存

        6.3.1   待細(xì)胞融和度達(dá)到約 80%后進(jìn)行傳代（細(xì)胞不能太密集，否則容易分化），吸棄傳代板孔中的培養(yǎng)基，每孔加適量 DPBS 輕輕沖洗 1 次。

         6.3.2  根據(jù)培養(yǎng)皿適量加入重組胰酶-EDTA（貨號(hào)：NA079-100ML，T25 建議使用 1ml），在 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱作用 3~5 min（可輕拍培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞脫落）。

6.3.3 顯微鏡下觀察細(xì)胞*脫落后, 根據(jù)重組胰酶-EDTA 使用量加入10 倍體積的大豆胰

酶抑制劑（1X），1000rpm 離心 3~5min。例：用 1ml 重組胰酶-EDTA，則加入 1ml

大豆胰酶抑制劑（1X）與細(xì)胞混和均勻，再離心。

             6.3.4謹(jǐn)慎吸出上清，細(xì)胞團(tuán)塊用適當(dāng)體積的*培養(yǎng)基懸浮后，混勻細(xì)胞懸液。

             6.3.5 按照所需的比例進(jìn)行傳代或按照 5000-6000cells/cm2 的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中，放入 37℃, 5% CO₂ 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

             6.3.6每 2-3 天更換一次培養(yǎng)基， 待細(xì)胞融合度達(dá)到 80% 左右時(shí)，參照操作步驟

6.3.1~6.3.5 做細(xì)胞傳代;或者參照操作步驟 6.3.1~6.3.3 收獲細(xì)胞凍存。

        6.3.7 細(xì)胞凍存：將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于適量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 凍存液（貨號(hào)： NA712-10ML）中，裝入凍存管，2~8℃冰箱放置 30min，-80℃冰箱放置 24h，轉(zhuǎn)入液氮罐凍存。

注：本方法僅供參考，用戶可根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)做合理調(diào)整。附圖：（如下是組織塊法，建議客戶可以嘗試消化法）